Transcrito de la camara de Neubauer
Recuento de eritrocitos:
ejemploObserve que en la grilla de la cámara de Neubauer las áreas de recuento de eritrocitos y linfocitos son diferentes. Los glóbulos rojos se cuentan en las áreas coloreadas de rojo, mientras que los glóbulos blancos se cuentan en las áreas coloreadas de azul. Ten en cuenta que la grilla central tiene 25 cuadrados de 1mm x 1mm de área y 0.10 mm de profundidad. El factor de dilución es por tanto de 1:200. Convierte el número de glóbulos rojos contados en 5 cuadrados a nº glóbulos rojos/µl. (1 µl (microlitro) = 1 mm3 )La imagen de abajo simula el campo que esta viendo al microscopio con un objetivo de 45x.
Solo es visible el centro de la grilla. Intenta verificar esto al ir moviendo el campo de derecha-izquierda y de arriba-abajo, como si de una pletina de microscopio se tratase. Cuenta los glóbulos rojos en los cinco cuadrados mencionados anteriormente y determina el recuento de eritrocitos como se ha descrito anteriormente..Muy importante: Cuando un eritrocito se sitúa en mitad de las líneas superior y/o de la izquierda, entonces es contabilizado. Pero no se contabiliza cuando se sitúa en mitad de las líneas inferior y/o de la derecha..El rango normal de recuento de glóbulos rojos es el siguiente:Mujeres:3.9-5.6 millones/µlHombres:4.5-6.5 millones/µlTécnicas de estudio de líneas celularesUna suspensión celular se caracteriza porpresentar un número de partículas microscópicas dispersas en un fluido.Habitualmente será necesario determinar tanto la densidad de las células enla suspensión como el porcentaje de éstas que son viables.
Para determinar la densidad de las células seemplean diferentes técnicas, desde la relativamente simple cámara de contajecelular de la que existen numerosas variantes, entre ellas la que empleamos(cámara de Neubauer), hasta equipos automáticos de contaje celular como el"Cell Coulter"El principio del contador celular se basa en lamedida de los cambios en la resistencia eléctrica que se producen cuandouna partícula no conductora en suspensión en un electrolito atraviesa unpequeño orificio. Como se puede ver en el esquema, una pequeña abertura entrelos electrodos es la zona sensible a través de la que pasan las partículasque se encuentran en suspensión. Cuando una partícula atraviesa el orificiodesplaza su propio volumen de electrolito.

El volumen desplazado es medidocomo un pulso de voltaje. La altura de cada pulso es proporcional alvolumen de la partícula. controlando la cantidad de la suspensión quecircula a través del orificio es posible contar y medir el tamaño de laspartículas. Es posible contar y medir varios miles de partículas por segundo,independientemente de su forma, color y densidad.Sinembargo, esposible determinar la densidad celular empleando métodos más sencillos.
Nosbasta con una cámara de contaje celular, por ej. la cámara de Neubauer, y unmicroscopio. Una cámara de contaje celular es un dispositivo en el que secoloca una muestra de la suspensión a medir. El dispositivo presenta unasseñales que determinan un volumen conocido (x microlitros). Al contar bajo elmicroscopio el número de partículas presentes en ese volumen se puededeterminar la densidad de partículas en la suspensión de origen.
La cámara de Neubauer es una cámara de contajeadaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se tratade un portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo de la cualse ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se veen la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre doslineas consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área sombreada y marcada Lcorresponde a 1 milimetro cuadrado.
La depresión central del cubreobjetosestá hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubrecon un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1 milímetro, y elvolumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1milímetro cúbico, es decir 0.1 microlitro.Si contamos las cuatro áreas sombreada (L)observando un total de x células entre las cuatro áreas, la concentración enla suspensión celular será :concentración en la suspensión (células / mL) =10000 (x/4)En la imagen puedes observar el aspecto de unade las regiones marcadas como L y que en el microscopio se ven como unacuadrícula de 16 pequeños cuadrados de 0.25 milímetros de lado. Esta imagenha sido tomada empleando un microscopio invertido de contraste de fases.Existen numerosos modelos de cámaras de contajecelular adaptadas a su uso en microscopía. En la imagen puedes observar unacámara de Neubauer doble, como las que usas en el laboratorio de prácticas.Para determinar la viabilidad celular seemplean diferentes métodos. El más común es el de tinción con azul tripán.El azul tripán es un coloide que se introduce en el interior de las célulasque presentan roturas en la membrana. Así pues las células que aparecen enla imagen, claramente de color azul, son consideradas no viables.

Asimilarcélulas blancas, por exclusión, a células viables es un error pues por estemétodo se sobrevalora la viabilidad de las células en la suspensión,determinando como inviables sólo aquellas con la membrana rota. Existenotros métodos de determinación de la viabilidad celular como el más precisode la tinción con ioduro depropidioseaseptiza el dedo con alcohol y luego se seca al aire o con algodón. Se cogeentre el pulgar y el índice y se hace una punción rápida y penetrante através de la piel de la punta del dedo con una lanceta estéril.2. Se deshecha la primeragota de sangre y se aspira la siguiente con la pipeta de diluciónperfectamente limpia y seca hasta la señal 1 o 0.5 (también puede utilizarsela pipeta de hemoglobina, de 20 microlitros).

Hay que evitar la entrada deburbujas de aire, pudiendo ayudarnos de un papel de filtro para conseguir elenrasado.3. A continuación se toma conla pipeta líquido de Hayem, isotónico con la sangre, hasta la señal 1; así,la sangre queda diluida al 1/10, si tomamos sangre hasta la señal 1, o al1/20 si tomamos hasta 0.5. Esto es así porque el volumen de la bola de lapipeta es 100 veces superior al del capilar de la misma. (Si hemos utilizadola pipeta de hemoglobina podemos diluir su contenido en 2 o 4 ml de líquidode Hayem para obtener diluciones 1/100 o 1/200).4.

Tomamos la pipeta (o eltubo de ensayo) entre los dedos índice y pulgar y agitamos. A través de lagoma de conexión con la pipeta, soplamos para despreciar las primeras gotaspor corresponder al líquido que estaba en el capilar5. Se adapta un cubreobjetossobre una cámara cuentaglóbulos limpia y seca y se coloca una gota en uno delos lados del cubre; esta gota penetra por capilaridad y rellena el retículode la misma.6. Una vez preparada lacámara se coloca sobre la platina del microscopio dejándose unos minutos enreposo para que sedimenten los glóbulos. Disponemos el condensador bajo y luzdébil; enfocamos primero con el objetivo débil seco y luego se cambia alfuerte seco para proceder al recuento, que se lleva a cabo en los cuadradospequeños del retículo marcado en color rojo. Finalizado el recuento seprocede a la limpieza de la pipeta con acético 1:3, agua destilada yalcohol-éter sucesivamente.7.El volumen de sangre en elcual se han contado las células resulta de multiplicar la profundidad de lacámara por el factor de dilución, la superficie de los cuadrados y el númerode cuadrados contados.Con cámara de NEUBAUER:

Superficie de 1cuadrado grande (1/20 mm de lado):Si contamos "a" glóbulos rojos en"n" cuadrados pequeños, el número de glóbulos por cuadrado seráa/n.Si en un volumen 1/4000 mm3 hay a/nglóbulos rojos, en 1 mm3 habrá X. Luego:siendo X el número de glóbulos rojos existentespor cada mm3 de sangre diluida.Si la sangre se diluyó a 1/100 o 1/200,habrá que multiplicar el valor X por 100 o 200 respectivamente, con lo cualobtendremos un nuevo valor, Y, que representa el número de glóbulos rojosexistentes por cada mm3 de sangre (sin diluir).Se utilizan para calcular, mediante el uso delmicroscopio, el número de partículas (leucocitos, hematíes, bacterias…) porunidad de voluimen de un líquido.La cámara está constituida poruna placa base de vidrio especial pareciso a un porta, su parte central seencuentra separada de los extremos por unas ranuras. en ella se encuentran lascuadrículas de recuento.La fórmula de contaje es:partículas/mm3= partículas contadas.Clases de cámaras:- Neubauer improved: Es el másutilizado (9 cuadros grandes, cada 1 de 1 mm2.)- Neubauer: La diferencia esel cuadro grande central.- Thoma: Se utiliza solo parael recuento de eritrocitos.- Fuchs-Rosenthal: Se utilizahabitualmente para recuento de células en líquidos orgánicos (LCR, Líquidosinovial